甲硝唑ELISA檢測試劑盒

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

     本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜等樣本中的甲硝唑（Metronidazole，MNZ），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的甲硝唑和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗甲硝唑抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含甲硝唑含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中甲硝唑的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃ 30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

組 織（雞、鴨肉/肝臟、魚、蝦、等）…………0.25ppb

蜂蜜 ………………………………………………0.25ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

與類似物的交叉反應(yīng)率：

甲硝唑(MNZ) ………………………………………100%

二甲硝咪唑DMZ……………………………………68%

2.5 樣本回收率：

魚/蝦/禽/肝臟………………………………90±10%

蜂蜜樣本 ……………………………………90±10%

3 試劑盒組成 

酶標(biāo)板1塊，96孔/板

標(biāo)準(zhǔn)液6瓶（黑蓋）：1ml/瓶

0 ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液  100 ppb ………………………………1ml

抗體工作液 (藍(lán)蓋)………………………………5.5ml

酶標(biāo)記物 (紅蓋)…………………………………11ml

底物液A (白蓋)……………………………………6ml

底物液B(黑蓋) ……………………………………6ml

終止液(黃蓋) ………………………………………6ml

20X濃縮洗滌液(白蓋)……………………………40 ml

2X濃縮復(fù)溶液(黃蓋)…………………………… 50 ml

說明書………………………………………………1份                                                                                                     

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：NaOH、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙酯

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.1M碳酸鹽緩沖液

稱取4.66g無水碳酸鈉，0.5g碳酸氫鈉去離子水500ml溶解，pH 10.6 。 

配液2：2M 氫氧化鈉溶液

稱取40g氫氧化鈉，加入去離子水500ml溶解。

配液3：洗滌液

將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水稀釋。

20X濃縮洗滌液在使用前請按1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水）。可按需配置，稀釋后的洗滌液可在4℃保存一個月。

配液4：復(fù)溶液

    將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水1:1稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1組 織（雞、鴨肉/肝臟、魚、蝦、等）、蜂蜜

1）取3g樣本，加3ml 0.1M 碳酸鹽緩沖溶液振蕩至蜂蜜全部溶解；

2）加入9ml 乙酸乙酯，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；

3）取上層有機相6ml至另一離心管中，加入2ml乙酸乙酯，2ml 2M氫氧化鈉溶液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；

4）取4ml清澈上層有機相至干凈玻璃試管中，30～40℃氮氣或空氣吹干；

5）加入正己烷1ml，渦動30s，再加入0.5ml復(fù)溶液混合30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上，離心5分鐘；

6）去除上層有機相，取下層50µl液體用于分析。

稀釋倍數(shù)  0.5           檢測下限   0.25ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。